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<title>Zellfreie Genexpression</title>

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<h1 id="firstHeading" class="firstHeading mw-first-heading"><span class="mw-page-title-main">Zellfreie Genexpression</span></h1>

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<div id="mw-content-text" class="mw-body-content mw-content-ltr" lang="de" dir="ltr"><div class="mw-content-ltr mw-parser-output" lang="de" dir="ltr"><p>Die <b>zellfreie Genexpression</b> (<i><a href="In_vitro" title="In vitro">in vitro</a></i>-<a href="Genexpression" title="Genexpression">Genexpression</a>, zellfreie Proteinsynthese, <i>in vitro</i>-<a href="Translation_(Biologie)" title="Translation (Biologie)">Translation</a>) ist eine im Labor angewendete Methode zur Erzeugung von <a href="Protein" title="Protein">Proteinen</a>, meist von <a href="Rekombinantes_Protein" title="Rekombinantes Protein">rekombinanten</a> Proteinen.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Eigenschaften">Eigenschaften</h2></div>

<p>Zur <a href="Biosynthese" title="Biosynthese">Biosynthese</a> von <a href="Protein" title="Protein">Proteinen</a> wird nicht die Integrität einer lebenden <a href="Zelle_(Biologie)" title="Zelle (Biologie)">Zelle</a> benötigt. So kann auch der <a href="Transkription_(Biologie)" title="Transkription (Biologie)">Transkriptions</a>- und <a href="Translation_(Biologie)" title="Translation (Biologie)">Translationsapparat</a> einer <a href="Zytolyse" class="mw-redirect" title="Zytolyse">lysierten</a> Zelle verwendet werden. Energieträger und <a href="Aminos%C3%A4ure" class="mw-redirect" title="Aminosäure">Aminosäuren</a> werden über ein Membransystem zugegeben.

</p><p>Der größte Vorteil dieser Methode gegenüber der Synthese in Zellen ist, dass auch <a href="Toxizit%C3%A4t" title="Toxizität">toxische</a> Proteine synthetisiert und <a href="Nichtproteinogene_Aminos%C3%A4uren" title="Nichtproteinogene Aminosäuren">nichtproteinogene Aminosäuren</a> eingeführt werden können. Gegenüber chemischer Proteinsynthese zeichnet sie sich durch die einfachere Herstellung langer Aminosäureketten aus. Beide Methoden, zellfreie Genexpression und chemische Synthese, haben ihre Vor- und Nachteile, was z. B. Länge, Aminosäuresequenz und Quantität des erhaltenen Proteins betrifft.

</p><p>Im Labormaßstab werden die Proteine häufig in <a href="Lyse_(Biologie)" title="Lyse (Biologie)">Lysaten</a> oder <a href="Extraktion_(Verfahrenstechnik)" class="mw-redirect" title="Extraktion (Verfahrenstechnik)">Extrakten</a> aus <a href="Escherichia_coli" title="Escherichia coli">E. coli</a>, Insektenzellen, <a href="Weizen" title="Weizen">Weizenkeimen</a> oder Säugerzellextrakte aus K562-Zellen, <a href="CHO-Zellen" title="CHO-Zellen">CHO-Zellen</a> oder <a href="Retikulozyten" class="mw-redirect" title="Retikulozyten">Retikulozyten</a> von Kaninchen erzeugt.<sup id="cite_ref-1" class="reference"><a href="#cite_note-1"><span class="cite-bracket">[</span>1<span class="cite-bracket">]</span></a></sup><sup id="cite_ref-2" class="reference"><a href="#cite_note-2"><span class="cite-bracket">[</span>2<span class="cite-bracket">]</span></a></sup><sup id="cite_ref-3" class="reference"><a href="#cite_note-3"><span class="cite-bracket">[</span>3<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Die Extrakte werden mit einer, in der Regel mittels <a href="In-vitro-Transkription" title="In-vitro-Transkription">in vitro-Transkription</a> erzeugten, <a href="Ribonukleins%C3%A4ure" title="Ribonukleinsäure">RNA</a> und einer Aminosäuremischung in einem geeigneten <a href="Puffer_(Chemie)" title="Puffer (Chemie)">Puffersystem</a> inkubiert. Die erzeugten Proteine können anschließend im <a href="Western_Blot" title="Western Blot">Western Blot</a> nachgewiesen und abhängig vom Protein ihre Eigenschaften, wie der Substratumsatz bei <a href="Enzym" title="Enzym">Enzymen</a>, oder die <a href="Protein-DNA-Interaktion" title="Protein-DNA-Interaktion">DNA-Interaktion</a> bei <a href="Transkriptionsfaktor" title="Transkriptionsfaktor">Transkriptionsfaktoren</a>, untersucht werden. Um die synthetisierten Proteine nachzuweisen, kann eine Aminosäure auch durch eine <a href="Isotopenmarkierung" title="Isotopenmarkierung">radioaktiv markierte</a> (meistens <sup>35</sup>S-Methionin) oder eine mit einem <a href="Fluoreszenzfarbstoff" class="mw-redirect" title="Fluoreszenzfarbstoff">fluoreszierenden Farbstoff</a> markierte Aminosäure ersetzt werden. Die entsprechenden Translationsextrakte sind als <i>Kits</i> von verschiedenen Anbietern erhältlich. Ein Nachteil der Methode ist die Gefahr des Abbaus der RNAs durch <a href="Ribonuklease" class="mw-redirect" title="Ribonuklease">RNasen</a>. Daher und wegen der damit verbundenen Zeitersparnis haben sich Systeme, bei denen Transkription und Translation gekoppelt sind, durchgesetzt. Die kommerziell erhältlichen Extrakte werden, zusätzlich zu Aminosäuren und Puffer, mit der geeigneten <a href="RNA-Polymerase" class="mw-redirect" title="RNA-Polymerase">RNA-Polymerase</a> aus <a href="Bakteriophagen" title="Bakteriophagen">Bakteriophagen</a> (T3, <a href="T7-RNA-Polymerase" title="T7-RNA-Polymerase">T7</a>, SP6) und dem gewünschten DNA-Template, einem <a href="Plasmid" title="Plasmid">Plasmidvektor</a>, der flankierend zur <a href="Polylinker" title="Polylinker">multiplen Klonierungsstelle</a> mindestens einen geeigneten <a href="Promotor_(Genetik)" title="Promotor (Genetik)">Promotor</a> enthält, versetzt.

</p><p>In Deutschland forscht u. a. die <a href="Fraunhofer-Gesellschaft" title="Fraunhofer-Gesellschaft">Fraunhofer-Gesellschaft</a> im Rahmen des <a href="BMBF" class="mw-redirect" title="BMBF">BMBF</a>-Strategieprozesses "Biotechnologie 2020+" an der Weiterentwicklung der zellfreien Genexpression. Ziel ist die Entwicklung eines modularen Bioreaktor für die effiziente zellfreie Proteinsynthese.<sup id="cite_ref-4" class="reference"><a href="#cite_note-4"><span class="cite-bracket">[</span>4<span class="cite-bracket">]</span></a></sup>

</p><p>Alternativ kann teilweise ein Protein <i><a href="In_vitro" title="In vitro">in vitro</a></i> per chemischer <a href="Merrifield-Synthese" title="Merrifield-Synthese">Merrifield-Synthese</a> von Peptiden und anschließender <a href="Proteinligation" title="Proteinligation">Proteinligation</a> erzeugt werden.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Literatur">Literatur</h2></div>

<ul><li>Lutz Essers: <i>Renaissance der zellfreien Proteinbiosynthese.</i> In: <a rel="nofollow" class="external text" href="http://www.genomxpress.de/content/ausgaben/GenomXPress-2008-4.pdf">GENOMXPRESS 4.08</a> (PDF; 8,2 MB), S. 13–15 (Übersichtsartikel)</li></ul>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Einzelnachweise">Einzelnachweise</h2></div>

<li id="cite_note-1"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-1">↑</a></span> <span class="reference-text">T. Terada, T. Murata, M. Shirouzu, S. Yokoyama: <i>Cell-free expression of protein complexes for structural biology.</i> In: <i>Methods in molecular biology.</i> Band 1091, 2014, S. 151–159, <a href="Digital_Object_Identifier" title="Digital Object Identifier">doi</a>:<span class="uri-handle" style="white-space:nowrap"><a rel="nofollow" class="external text" href="https://doi.org/10.1007/978-1-62703-691-7_10">10.1007/978-1-62703-691-7_10</a></span>, <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24203330?dopt=Abstract">PMID 24203330</a>.</span>

</li>

<li id="cite_note-2"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-2">↑</a></span> <span class="reference-text">A. K. Brödel, D. A. Wüstenhagen, S. Kubick: <i>Cell-free protein synthesis systems derived from cultured mammalian cells.</i> In: <i>Methods in molecular biology.</i> Band 1261, 2015, S. 129–140, <a href="Digital_Object_Identifier" title="Digital Object Identifier">doi</a>:<span class="uri-handle" style="white-space:nowrap"><a rel="nofollow" class="external text" href="https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2230-7_7">10.1007/978-1-4939-2230-7_7</a></span>, <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25502197?dopt=Abstract">PMID 25502197</a>.</span>

</li>

<li id="cite_note-3"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-3">↑</a></span> <span class="reference-text">Dmitriy A. Vinarov, Carrie L. Loushin Newman, Ejan M. Tyler, John L. Markley, Mark N. Shahan: <i>Wheat Germ Cell‐Free Expression System for Protein Production.</i> In: <i>Current Protocols in Protein Science</i> (2006). Band 44, Ausgabe 1, S. 5.18.1-5.18.18. <a href="https://doi.org/10.1002/0471140864.ps0518s44" class="extiw external" title="doi:10.1002/0471140864.ps0518s44">doi:10.1002/0471140864.ps0518s44</a>.</span>

</li>

<li id="cite_note-4"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-4">↑</a></span> <span class="reference-text"><a href="Fraunhofer-Institut" class="mw-disambig" title="Fraunhofer-Institut">Fraunhofer-Institut</a>: <a rel="nofollow" class="external text" href="http://www.zellfreie-bioproduktion.fraunhofer.de/"><i>Systemforschungsprojekt zellfreie Bioproduktion</i></a>.</span>

</li>

</ol></div><div><div class="zim-footer">

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